翰颐被投企业宁康瑞珠创始人熊豫生博士专访

我们知道，血液中的低密度脂蛋白也被称做“坏胆固醇”，其水平与心血管疾病直接相关，是导致动脉粥样硬化的罪魁祸首。胆固醇是我们人体细胞的重要组成部分，也是多种激素的基本原料。可以说，没有胆固醇就没有生命。血液中的低密度脂蛋白由肝细胞表面的LDLR调节，LDLR的丰富程度直接决定血液中低密度脂蛋白的水平。具有家族特征的单基因遗传的家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia, FH）患者，血液低密度脂蛋白水平很高，可以达到190mg/dL（4.9 mmol/L）。而且这里患者在55-60岁之前患心肌梗塞或者脑卒中的几率比一般人高10-20倍。绝大部分（90%以上）是因为LDLR本身的突变造成，另外还有5%是因为ApoE的突变，PCSK9的突变只占大约1%。

PCSK9（前蛋白转化酶枯草溶菌素9）是科学界和制药界的传奇靶点，PCSK9由肝细胞产生后分泌到血液中，与低密度脂蛋白LDLR结合介导其降解。2003年被法国科学家Abifadel et al. 首次报道，在一个法国家庭中PCSK9的功能获得性突变（gain-of-function mutation）导致家族性高胆固醇血症，该遗传特征是单基因显性遗传。该发现导致了后续的一系列重要发现，2005年美国德州大学西南医学中心的达拉斯心脏研究计划报道了一个非裔家庭中PCSK9的功能缺失性突变（loss-of-function mutation）导致极低的血液低密度脂蛋白水平和动脉粥样硬化风险。

因为PCSK9是分泌蛋白，人类遗传学证据很强，作用机理基本清晰，这一系列特性使得PCSK9成为制药界的完美靶点。最直接的方法就是采用PCSK9的单克隆抗体，阻断PCSK9与LDLR的结合，使得LDLR不被降解来维持其调节低密度脂蛋白水平的功能。几乎所有大的药企都布局过这方面的管线，最后胜出的是再生元-赛诺菲合作的Praluent（波立达，2020年4月在中国获批）和安进的Repatha（2015年7月在欧盟获批，2015年8月在美国获批，“瑞百安”于2018年在中国获批）。这两款产品各有优劣，推出的时候曾经被定位为重磅药，但市场表现似乎并不如预测的那么好。

赛诺菲和安进在PCSK9抗体药的专利上有多年的纷争，2017年赛诺菲被判侵犯了安进的同类药物Repatha的专利，停售Praluent 12年。2020年4月赛诺菲在与安进就PCSK9抑制剂的专利诉讼中败诉，赛诺菲宣布Praluent退出日本市场。相关的报道非常多，这里就不做详细分析了。

除了采用抗体，更有效的方法是采用RNAi技术直接在肝细胞降解PCSK9。Alnylum早在2010年左右就开始利用其肝细胞靶向GalNAC - RNAi平台技术进行这方面的研究，后来在2013年开始与The Medicines Company合作开发该产品Inclisiran。2016年公布的二期临床结果让人振奋，皮下注射300毫克将血液低密度脂蛋白水平降低50%，效果持续6个月。该产品后来转让给The Medicines Company，做完三期临床后于2019年被诺华以97亿美元收购。Inclisiran已经于2020年11月在欧洲获批，但是因为生产的问题一阵未被FDA批准。

除了皮下注射的Inclisiran，阿斯利康在2021年5月报道了口服PCSK9反义寡核苷酸（ASO）的临床结果，重复给药可以获得7%的生物利用度，口服15毫克在稳态可以降低80%的血液PCSK9水平。国内也有公司在进行PCSK9小核酸的开发，如苏州瑞博的PCSK9小核酸一次皮下注射9毫克每公斤体重，可以降低低密度脂蛋白胆固醇，作用持续长达100天。

对于降低胆固醇这样的有临床证明的有效治疗方式，口服药的优势是巨大的。从PCSK9 靶标的提出，许多大公司就开始在各自的化合物库筛选小分子药苗。默沙东也不例外，采用不同的Assay，包括LDL uptake，LDLR降解等实验，经过数次筛选几百万化合物的化合物库都无果。最后用一个Biacore的Binding assay终于找到了一个很弱的PCSK9的结合分子，该小分子的结合部位不在PCSK9与LDLR 的接触区，因此没有显示出抑制LDLR降解的生物活性。即便如此，公司也没有放弃这个变构结合分子，而是下定决心、排除万难，在项目初期没有合适的Assay情况下，硬是用PCSK9蛋白的熔点升高来优化分子，直到能做到有一定活性的分子探针建立了一个高通量的Assay。最终把这个Ki 只有10 uM 的结合分子优化到Ki 达到nM 量级，并优化出可渗透到细胞内的结合分子。可惜最后还是没有看到任何生物活性，包括干扰PCSK9和LDLR的结合，降低PCSK9的分泌，增加PCSK9的降解，等等。最后只好放弃了小分子变构抑制剂的计划。但是后来这个工具小分子被用来尝试用PROTAC的方式来加速PCSK9的降解。

位于波士顿的生物科技公司Dogma Therapeutics宣称他们通过高分辨率蛋白晶体结构找到了与PCSK9结合活性达到pM的小分子，在临床前动物中显示降低胆固醇水平。2020年9月被阿斯利康收购。此外，PCSK9的基因转录和表达受到SCAP-SREBP通路的调控，因此也有公司利用小分子抑制SCAP-SREBP通路来抑制PCSK9的转录，但是PCSK9和LDLR的转录都受同一通路调控，降低PCSK9的表达也同时降低LDLR的表达，所以这种做法最后都被放弃。

PCSK9与LDL受体结合部位的X-ray结构显示没有凹凸不平的结合域空腔，这部分解释了采用小分子抑制剂来干扰PCSK9：LDLR之间结合非常困难的原因。默沙东进而采用了比小分子大一些的环肽来干扰PCSK9：LDLR之间的结合，也就是PCSK9环肽抑制剂。正好当时公司在与擅长mRNA 展示肽技术的生物科技公司 RA Pharma商讨合作，PCSK9就顺理成章成为一个最好的合作靶点。

mRNA 展示技术在筛选短肽和环肽方面是目前效率最高最强大的一种技术。该领域的先驱包括美国的RA Pharma和日本的PeptiDream。利用该技术理论上可以筛选出与任何已知蛋白相结合的肽，包括受体的配体，干扰蛋白-蛋白之间相互结合的分子等。对于一些所谓“不可成药”空间（undruggable space）开辟了新的成药可能性。mRNA 展示技术在离体条件下利用蛋白质的生物合成过程（DNAàmRNAàprotein），并“劫持”了一些没用到的核酸码来编码非天然氨基酸到环肽中以改善肽的结构多样化和成药性。另外，mRNA化合物库的筛选过程也与其它化合物库技术（如DEL）不同。生物合成的线性肽分子通过特定位置上的丝氨酸环化成大小确定的环肽，但每个肽分子都还接着编码它的mRNA。在多轮次的筛选－再合成的进化过程中，每轮筛选过程中都利用对靶标蛋白亲和力的差别在洗脱后富集了亲和力较强的环肽。下一步利用编码的mRNA 反转录为相应的DNA，并用PCR来扩增得到一个新的不带肽分子部分的DNA化合物库。这样再开始下一轮环肽的生物合成过程：DNR à mRNA à peptide àcyclic peptideà筛选。经过如此循环６－７次，最后得到的DNA库就富集了许多亲和力较强的序列。经过测序和统计分析挑选出为数不多的序列，采用固相合成的方法合成出毫克量级的环肽来进行多种检测以确证环肽的生物活性。

与传统意义上的化合物库相比，这样的mRNA 化合物库的体量仍然是很小的，每个序列不同的肽分子只有1~100 个拷贝，远远不是化学合成的化合物库那么“宏观”，一个1013大小的肽分子化学空间可以轻而易举的用mRNA 展示库 筛选一遍。因此，只要靶标的亲和力检测方法构建的好，基本上环肽的药苗都能找到。像PCSK:LDLR 这样没有结合域空腔的平滑接触部位，我们花了几个月的时间就找到了几个12个氨基酸的环肽药苗，当然亲和力只有Ki ~ 1 uM，远远达不到成药的活性，尤其是对于口服给药的途径，由于环肽的生物利用度非常低，我们需要采用提高化合物活性的方法来弥补生物利用度的不足，使得吸收入血的非常低浓度的化合物仍然具有药物疗效。

从药苗到临床化合物的优化（Lead optimization）是药物化学家的拿手戏。默沙东的一个由多个地域、不同部门组成的大团队花了两年多时间从各个方面对药苗进行优化。把12个氨基酸的环肽优化到8个氨基酸，同时大大增加了环肽的成药性，包括溶解度的改善（比如Lysine侧链引入类似PEG短链），代谢稳定性的增加（D-氨基酸、氨基酸a-甲级化、N-甲级化），除去致敏性（Lysine 侧链季铵盐化） 等等。最令人大跌眼镜的是环肽亲和力的增强：从1 uM 优化到 < 1 pM，增强了1百万倍！比上市的两个抗体亲和力还强（见参考文献2中的化合物49和51）。虽然环肽与PCSK9的结合部位没有凹凸的空腔，依靠多次跨环连接固化环肽的空间构象可以大大加强化合物与PCSK9结合的亲和力，这是很多人始料不及的。一个10个氨基酸（10-AA）的环肽，从中间连接起来成为两个5-AA的二环肽，其可采取的空间构象数目是极大减少了，因为即便是远离连接点的氨基酸，也因为从10-AA环的一部分变成了5-AA环的一部分而失去了很多低能量的空间构象。这种依赖降低肽分子的空间自由度来增加肽分子与蛋白亲和力的效率远远高于在小分子骨架上的同样做法。

亲和力的增加不仅提高了对靶标的选择性，也大大降低了对化合物在PK和生物利用度上的压力，口服小环肽的成药性也大大提高了。这个亲和力可优化的空间对整个环肽领域都是一个极大的鼓舞。

目前PCSK9抗体药早已经上市，诺华的干扰小核酸也显示了很好的且持续的降胆固醇疗效，口服PCSK9环肽抑制剂似乎有很多强大的竞争对手。默沙东在推进口服PCSK9环肽抑制剂的时候一定是做过非常全面的权衡的，例如当年在推PCSK9抗体药的时候，在考虑过竞争和上市时间的劣势之后就做出了终止开发的决定。尤其对于全球第一个推出他汀类降胆固醇药物的制药公司，这方面的考量不会草率。我们不清楚默沙东将来是否会继续推进PCSK9环肽抑制剂，但是这次的临床结构还是非常振奋人心的，因为它为这种新型口服药物提供了安全性依据和概念验证。可以设想将来还会有类似于PCSK9的靶点可以采用口服环肽抑制剂的方法，解决不可成药的问题。另外有些现有的抗体药物或许可以被口服环肽代替，提高用药方便和依从性。即使默沙东因为商业上的原因不继续推进PCSK9口服环肽抑制剂，我认为这方面的探索仍然意义非常重大。作为一种新的药物形态（drug modality），环肽也许可以在一些难成药的领域发挥自己的优势。当然，环肽的合成成本会比一般小分子要高。对于工艺开发擅长的默沙东Process Chemists 是发挥他们技能的用武之地，我期待他们的PCSK9环肽工艺开发的好文章。